DNA-Extraktionsmethoden

DNA-Extraktionsmethoden

Es gibt viele Extraktionsmethoden und sie unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, DNA effizient zu extrahieren. Einige der zu berücksichtigenden Faktoren sind die Art der zu analysierenden Probe, die für die Verarbeitung erforderliche Zeit, der Eingriff des Bedieners, das Kontaminationsrisiko sowie die Schwierigkeit oder Benutzerfreundlichkeit. Dies ist die Grundlage für eine erfolgreiche forensische DNA-Profilerstellung. Die Aufgabe der Methode der Wahl sollte nicht nur sicherstellen, dass DNA effizient aus jeder Probe extrahiert wird, sondern auch potenzielle Inhibitoren eliminieren, die andere Prozesse wie die Amplifikation stören könnten.

DNA-Extraktionsmethoden
Techniken zur DNA-Extraktion

Eine der häufigsten Techniken bei der DNA-Extraktion ist Chelex, ein Chelatharz, das mithilfe des Ionenaustauschs Übergangsmetallionen bindet, die die DNA vor dem Abbau schützen. Der Vorteil der Chelex-Methode besteht darin, dass sie schnell ist, keine Mehrfachröhrentransfers erfordert und keine toxischen organischen Lösungsmittel verwendet. Sein Hauptnachteil ist, dass es keine Inhibitoren entfernen kann, die den Amplifikationsprozess stören. Bei der Verarbeitung von Proben mit Inhibitoren wird eine Salzlösung verwendet, die Detergenzien und Proteasen enthält, um Proteine ​​zu denaturieren und DNA aus der Zelle freizusetzen. Es wird empfohlen, die in diesem Salzwasser durchgeführte organische Extraktionsmethode zu verwenden, bei der die Zellen abgebaut werden müssen.
Dieser Cocktail kann unter Verwendung eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches getrennt werden, wobei die DNA in der wässrigen Phase verbleibt. Die extrahierte DNA kann durch Ethanolfällung aus der wässrigen Phase oder durch eine Zentrifugalfiltereinheit konzentriert werden, die eine zusätzliche Reinigung und Konzentration der DNA in Proben ermöglicht. Der Vorteil der organischen Extraktionsmethode besteht darin, dass sie genetisches Material aus schwierigen Proben (abgebaute und / oder geringe Menge an DNA) erhalten kann. Es ist auch in der Lage, das Vorhandensein von Inhibitoren für die PCR erfolgreich zu eliminieren. Diese Methode bleibt zwar eine der zuverlässigsten und effizientesten Methoden, ist aber auch sehr zeitaufwändig. Es verwendet gefährliche Chemikalien und birgt aufgrund des größeren praktischen Aufwands und der damit verbundenen Mehrfachröhrentransfers ein erhöhtes Risiko für Kontamination und Probenmissbrauch.

Differenzielle Lyse in DNA-Gemischen

Die genetische Analyse von Beweisen, die bei Sexualverbrechen gesammelt wurden, umfasst häufig genetische Profile von zwei oder mehr Teilnehmern. In solchen Gemischen ist der genetische Beitrag von Individuen oft unausgewogen. In einigen Fällen leistet die Biomischung einen minimalen Beitrag, normalerweise der Täter bei sexuellen Übergriffen. Die genetische Rate dieses Spenders wird wahrscheinlich aufgrund von Empfindlichkeitsgrenzen oder Reaktionssättigung durch die größere Menge an Komponente nicht nachgewiesen. In den meisten Fällen kann der geringe Beitrag im DNA-Mix nicht nachgewiesen werden, wenn die Verhältnisse 1:20 überschreiten.
Das Erhalten von Beweisen bei sexuellen Übergriffen ist eine große Herausforderung für forensische DNA-Analysten. Weil es die Trennung von DNA von Epithelzellen (Opfer) und Spermienzellen (Versagen) erfordert. Die Differentialextraktion wurde erstmals 1986 von Gill und seinem Team als Modifikation der organischen Phenol-Chloroform-Extraktion beschrieben. Dies wird als Differentiallyse bezeichnet, da Nicht-Spermien durch Detergenzien und Proteasen selektiv abgebaut werden. Andererseits zersetzen sich die Zellen aufgrund der stark disulfidvernetzten Proteine ​​im Spermienkopf, die der Proteasebehandlung widerstehen, nicht. In forensischen DNA-Labors ist die Differentiallysemethode seit langem der Standard für die Trennung von Spermatozoen von Epithelzellen. Obwohl diese Technik theoretisch zwei Fraktionen liefern kann, wie bereits erwähnt, ist die Trennung nicht immer vollständig, was zu gemischten Genotypen führt.

Andere DNA-Extraktionsmethoden

Es gibt andere Methoden, um Spermien und Epithelzellen von Proben sexueller Übergriffe zu trennen. Das Differex ™ -Systemverfahren umfasst den Proteinase K-selektiven Verdau von Epithelzellen, gefolgt von Differentialzentrifugation und Phasentrennung. Die Verwendung dieser Methode in DNA-Labors zeigt, dass sie der zweistufigen Methode zur Extraktion von Spermien-DNA aus gemischten Färbungen die gleiche Effizienz bietet.

Molekulare Methoden zur Identifizierung des Menschen

Die erste Verwendung von DNA-Tests in einer forensischen Umgebung erfolgte 1986. In Leicestershire, England, wurden zwei Mädchen sexuell angegriffen und 1983 und 1986 brutal ermordet. Dieser Fall zeigte, dass ein Unschuldiger angeklagt wurde und ein Jahr später der schuldige Verbrecher gefunden und begangen wurde. In den letzten 30 Jahren hat sich die DNA-Molekularanalyse zu einem wichtigen Instrument in der forensischen Forschung entwickelt. Derzeit basiert das DNA-Profil auf Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Analysen. Diese Methode umfasst autosomale STRs, Y- und X-Chromosomen. PCR ist der Prozess, bei dem eine bestimmte Region im Genom immer wieder repliziert wird, um viele Kopien einer Region zu erstellen.
Die DNA muss vor der PCR gemessen werden. Dies ist entscheidend, um die korrekte Amplifikation sicherzustellen. Sein Hauptzweck ist die Quantifizierung der DNA-Matrize, die aus der Isolierung resultiert. Es gibt viele Methoden mit unterschiedlicher Genauigkeit, aber die Kenntnis der in den Proben vorhandenen DNA-Konzentration ermöglicht es dem Forensiker, die ideale Menge an DNA zu erzeugen, die für seine Amplifikation erforderlich ist, wodurch ein anhaltendes genetisches Profil erhalten werden kann. Die genetische Analyse von Beweisen, die bei Sexualverbrechen gesammelt wurden, umfasst häufig genetische Profile von zwei oder mehr Teilnehmern. In solchen Gemischen ist der genetische Beitrag von Individuen oft unausgewogen. Dies stört den Identifizierungsprozess weiter, möglicherweise durch eine Reihe von stochastischen Effekten wie die bevorzugte Amplifikation, von der bekannt ist, dass sie die PCR beeinflusst.

Short Tandem Repeat (STR) -Analyse

Mikrosatelliten oder STRs enthalten einen Nukleotidkern, der wiederholt wiederholt wird, und ihre Verwendung in der Forensik hat einen neuen Weg in der menschlichen Identifizierung eröffnet. Es ist bekannt, dass STRs aufgrund ihrer übermäßigen variablen Marker einen hohen Grad an Diskriminierung aufweisen. Dies ist nützlich, wenn Sie den Täter am Tatort oder Opfer einbeziehen möchten. Artefakte sind ein häufiges Problem in forensischen Fällen. Biologische und instrumentelle sollten häufig bestellt werden, um ein vollständiges und genaues STR-Profil zu erstellen. Biologische Beweise für fragmentierte DNA finden sich häufig bei sexuellen Übergriffen. Und wenn die PCR-Produkte kleiner sind, können sie effektiver gewonnen werden. Indem die PCR-Primer näher an die STR-Region gebracht werden, können die Produktgrößen reduziert werden, während die gleichen Informationen beibehalten werden. In der Praxis steigen die Erfolgsraten bei der Wiederherstellung von Informationen aus kompromittierten DNA-Proben mit Mini-STR-Systemen im Vergleich zu herkömmlichen STR-Kits.
DNA-ExtraktionsmethodenGeschlechtschromosomale STR zeigt die biologische Abstammung einer Person an und erreicht eine geringe Ausschlusskraft unter Verwandten. Y-STR-Marker können eine Rolle spielen, wenn eine unterschiedliche Extraktion nicht möglich ist, wenn gemischte Profile des anderen Geschlechts in einem azoospermischen männlichen oder älteren sexuellen Fleck vorliegen. X-STR-Marker haben eine Vielzahl von forensischen Anwendungen und können verwendet werden, um Beziehungen zwischen Verwandten wie Tanten, Nichten und Cousins ​​herzustellen. Darüber hinaus werden theoretische und erste empirische Belege dafür geliefert, dass der 13 RM Y-STR-Satz (sich schnell ändernde Y-STRs) eine höhere Größenordnung erreichen kann als die männliche relative Differenzierung. Die Auswirkungen dieser fast vollständigen männlichen Individualisierung sind in der forensischen Praxis von großem Nutzen. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um die Einbeziehung unschuldiger Personen in die Sexualforschung aufgrund zufälliger Haplotyp-Übereinstimmungen zu verringern.

Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs)

SNPs sind eine Einzelbasen-Sequenzvariation zwischen Individuen zu einem bestimmten Zeitpunkt und befinden sich in Millionen von Regionen im menschlichen Genom. Dies bedeutet, dass sie Individuen voneinander unterscheiden können. SNPs können Informationen aus abgebauten DNA-Proben gewinnen, die keine stochastischen Phänomene zeigen. Die Probenverarbeitung und Datenanalyse kann automatisiert werden, da keine größenbasierte Trennung erforderlich ist. Es hat auch die Fähigkeit, ethnische Zugehörigkeit und bestimmte körperliche Merkmale vorherzusagen. Eine der größten Herausforderungen bei der Verwendung von SNPs in forensischen DNA-Typisierungsanwendungen ist die Unfähigkeit, gleichzeitig eine ausreichende Anzahl von SNPs in robusten PCR-Multiplexen aus kleinen DNA-Mengen zu amplifizieren.
Da ein einzelner SNP weniger Informationen liefert als ein Multi-Allel-STR-Marker, müssen mehr SNPs analysiert werden, um eine angemessene Unterscheidungskraft zu erhalten. In der Vergangenheit konnten mit SNP-Arrays mit hoher Dichte Hunderttausende oder sogar Millionen von SNPs parallel analysiert werden. Die Grundprinzipien der SNP-Sequenz sind die Konvergenz von DNA-Hybridisierung, Fluoreszenzmikroskopie und DNA-Einfang auf fester Oberfläche. Die drei wesentlichen Komponenten von SNP-Sequenzen sind ein Array, das immobilisierte allelspezifische Oligonukleotid (ASO) -Sonden enthält. Die mit fluoreszierenden Farbstoffen markierten fragmentierten Zielnukleinsäuresequenzen sind ein Nachweissystem, das das Hybridisierungssignal aufzeichnet und interpretiert. Diese Sequenzen erfordern jedoch typischerweise Hunderte von Nanogramm DNA. Diese können normalerweise nicht aus forensischen Fallproben gewonnen werden, die durch kleine biologische Flecken verursacht wurden. Aus diesem Grund wird es in Ahnenstudien häufiger verwendet.
Eine andere Form eines biallelischen oder diallelischen Polymorphismus ist die Insertions-Deletion von Nukleotiden oder INDEL, die ein DNA-Segment sein können. Die meisten INDELs weisen Allele auf, die aus mehreren Nukleotidlängenunterschieden bestehen. PCR-Amplifikate wurden auf weniger als 160 bp ausgelegt, wodurch ein vollständiges Profil von bis zu etwa 300 pg DNA-Matrize erhalten werden konnte. Allerdings sind nicht alle INDELs in allen Populationen sehr informativ, und die genaue Anzahl der INDELs im menschlichen Genom ist unbekannt.
Sowohl SNPs als auch INDELs können jetzt mithilfe von Multiplexen basierend auf der Fragmentlängenanalyse auf Geräten typisiert werden, die in allen routinemäßigen forensischen Labors zu finden sind. Somit ist es möglich, den Markerbereich über die verwendeten STRs hinaus zu erweitern. In den letzten Jahren wurde eine große Anzahl von SNP-basierten Haplotypsystemen aufgrund ihrer Unterscheidungskraft nahe der von STRs als optimale Marker für das forensische Gebiet getestet, was eine leistungsstarke Alternative für die Analyse darstellt. Mikrohaplotypen (MHs) haben 2 oder mehr SNPs in einem Bereich von weniger als 200 Nukleotiden. Es hat eine ähnliche Unterscheidungskraft wie STRs und ist in Situationen mit extrem niedrigen Rekombinationsraten, fragmentierter DNA und Mischprobenanalyse nützlich.

Mitochondriale DNA-Analyse

Die Analyse der mitochondrialen DNA (mtDNA) wird normalerweise unter Verwendung der Sanger-Sequenzierungschemie durchgeführt. Diese DNA-Sequenzierung wird sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsrichtung durchgeführt. Komplementärgarne können somit zu Qualitätskontrollzwecken miteinander verglichen werden. Der Schwerpunkt der meisten bisherigen forensischen DNA-Studien liegt auf zwei hypervariablen Regionen in der Kontrollregion, die üblicherweise als HVI (HV1) und HVII (HV2) bezeichnet werden. Gelegentlich wird ein dritter Teil der Kontrollregion, bekannt als HV3, untersucht, um weitere Informationen über eine getestete Probe bereitzustellen. Es wird angenommen, dass menschliche mitochondriale DNA streng von Müttern geerbt wird und häufig in elterlichen Bindungen verwendet wird.
Der mittlere Teil der Spermien enthält mtDNA und diese DNA ist resistenter als autosomale DNA. Denn in kleinen kreisförmigen Genomen wirken die Doppelmembran der Mitochondrien und die kreisförmige Struktur als Schutzmittel gegen Abbauprozesse. Forensische Anwendungen für MtDNA umfassen die Analyse von abgebauten oder wenig DNA-Proben. Und das ist Zar II. Es wurde verwendet, um Nicholas und seinen Bruder Georgij Romanov zu identifizieren. Zusätzlich zur physikalischen Trennung wurden sequenzspezifische Primer (SSP) für Männer verwendet, um sicherzustellen, dass die weibliche mtDNA nicht co-amplifiziert wurde. Das primäre Design basiert auf den mtDNA-Haplotypunterschieden zwischen Teilnehmern, die nach mtDNA-Analyse von bukkalen Abstrichen identifiziert wurden. Dieses Verfahren ermöglicht die Charakterisierung des männlichen Mitotyps aus einer einzelnen Samenzelle, die in einem Vaginalabstrich enthalten ist und zur Identifizierung verwendet wurde. In einem neueren Ansatz wurde gezeigt, dass mtDNA verwendet werden kann, um Spermien im Vaginalkanal durch Mikromanipulationstechnik zu identifizieren.

Verweise:
europepmc.org/articles/pmc4637504
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-31802002000300004

Schriftsteller: Ozlem Guvenc Agaoglu

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