Was ist Next Generation Sequencing (NGS)? „Information

Was ist Next Generation Sequencing (NGS)?  „Information

Es gibt mehrere NGS-Plattformen (Next Generation Sequencing), die unterschiedliche Sequenzierungstechnologien verwenden. Sie alle sortieren parallel Millionen winziger DNA-Stücke. Bioinformatik-Analysen werden verwendet, um diese Fragmente zusammenzusetzen, indem einzelne Lesevorgänge auf das menschliche Referenzgenom abgebildet werden. Somit liefern sie genaue Daten und Einblicke in unerwartete DNA-Variationen. Die Basis des Verfahrens besteht aus DNA-Polymerase, die den Einbau von Desoxyribonukleotidtriphosphaten in eine DNA-Matrizenkette katalysiert. Während jedes Zyklus werden Nukleotide an der Verbindungsstelle durch Fluorophorstimulation identifiziert. Der entscheidende Unterschied besteht darin, dass NGS anstelle einer Sequenzierung eines einzelnen DNA-Stücks diesen Prozess im Wesentlichen parallel zu Millionen von Stücken erweitert.
Was ist Next Generation Sequencing (NGS)?

Die NGS-Analyse ermöglicht es, Unterschiede in der Reihenfolge der Nukleotide in der DNA zu finden, wenn die Allele gleich groß sind. Es ermöglicht auch die gleichzeitige Analyse mehrerer Polymorphismen in einem einzigen Workflow. NGS zeigt zusätzlich zur Wiederholungslänge eine signifikante Sequenzvariation. Somit erhöht es die Unterscheidungskraft von STRs im Vergleich zur herkömmlichen Fragmentanalyse. Außerdem können große SNP-Panels bei stark abgebauter DNA analysiert werden. Andererseits werden Informationen aus mehreren Analysen in NGS nicht in allen forensischen Fällen benötigt. Es kann große Teile der Sequenzierungskapazität beanspruchen, was letztendlich zu weniger Proben pro Sequenzierungslauf und höheren Forschungskosten führt. Erfahrungsgemäß ist eine zuverlässige Qualitätskontrollplattform für die Dimensionierung und Quantifizierung von Bibliotheken erforderlich.
NGS kann auch verwendet werden, um Mikroorganismen zu erkennen, die in biologischen Beweisen gefunden wurden, sexuell übertragbare Infektionen und das Post-Mortem-Intervall (PMI) zu schätzen. NGS analysiert jede Basis des Genoms und macht die nachgewiesenen Polymorphismen für eine schnelle Typisierung des gesamten Genoms geeignet. Somit hat es den Vorteil einer hohen Effizienz und Multiplexfähigkeit und -genauigkeit, was eine höhere Auflösung und eine höhere Genauigkeit für forensische Daten bietet. Edaphische, nekrobielle Mikroorganismen an der Grenzfläche zwischen Leichnam und Boden bilden Gemeinschaften mit mehreren Arten, die sich ändern, wenn der Wirtskörper stirbt und sich zu zersetzen beginnt. Die Charakterisierung dieser dynamischen Veränderungen wurde durch metagenomische Technologien ermöglicht. Es wird erwartet, dass bald eine hochwertige forensische mikrobielle Datenbank Realität wird, mit deren Hilfe Kriminelle und biologische Terroristen schnell und genau identifiziert werden können.
Auch die Identifizierung nichtmenschlicher Arten ist ein wichtiger Bestandteil der forensischen Praxis. Entomologische Beweise werden verwendet, um PMI zu identifizieren. Es basiert hauptsächlich auf der morphologischen Erkennung des Insekts und einer Abschätzung des Lebenszyklus des Insekts. Molekulare Genotypisierungsmethoden können jedoch eine wichtige Unterstützung für die forensische entomologische Forschung darstellen, wenn Arten oder menschliches genetisches Material im Verdauungssystem identifiziert werden müssen. Epigenetische Ansätze, die auf der NGS-Technologie basieren, umfassen die Bisulfit-Sequenzierung des gesamten Genoms und die Sequenzierung methylierter DNA.
Interessanterweise wurden geringe Mengen an Ausgangs-DNA (100 pg) erfolgreich durch quantitativen Methylierungsnachweis analysiert. Darüber hinaus war eine weitere ermutigende Studie die Sequenzierung von genomischer Bisulfit-DNA mit Blutvolumenproben mit Mikrovolumen. Dies kann auch verwendet werden, um den Gewebetyp und Assoziationen mit Krankheiten vorherzusagen und das Geschlecht und Alter eines DNA-Spenders zu bestimmen. Darüber hinaus war die Unterscheidung identischer Zwillinge eine Einschränkung in der forensischen Genetik, da sie dieselben STR-Profile aufweisen. Die hohe Anzahl von Lesevorgängen einer einzelnen Sequenz, die in der Lage ist, das NGS zu erreichen, ermöglicht es, Variationen von methylierter DNA und mitochondrialen SNPs zu erkennen und diese zu differenzieren.
MicroRNAs wurden erst kürzlich in die Forensik eingeführt. Es ist eine Klasse endogener kleiner RNA-Moleküle mit einer Länge von 18 bis 24 Nukleotiden. Dort spielen geringe Größe, Beständigkeit gegen Abbau und gewebespezifische oder stark gewebespezifische Expression eine wesentliche regulatorische Rolle für viele zelluläre Prozesse. Sie eignen sich für ein DNA-Profil zur Identifizierung einer bestimmten Körperflüssigkeit, zur Identifizierung von Arten, zu verschiedenen Krankheitszuständen und zur forensischen Identifizierung von Körperflüssigkeiten. Die NGS-Technologie in der Forensik erweitert den Anwendungsbereich, der zur Lösung von Strafsachen beiträgt. Die standardisierungsübergreifende Standardisierung von Verfahren führt zu einem Verständnis ihrer Verwendungen und Einschränkungen sowie ihrer Akzeptanz vor Gericht.

Stammbaum und phänotypischer Ausdruck

Menschen sind zu 99,9% in ihrer DNA identisch, und der Unterschied zwischen jedem menschlichen Genom ist gering. Bei der Analyse dieser kleinen Unterschiede hilft es jedoch zu verstehen, was es einzigartig macht. Die Variation zwischen menschlichen Genomen ist nicht zufällig auf der ganzen Welt verteilt. Menschen haben eher Nachkommen mit Menschen in der Nähe. Je näher zwei Individuen oder Populationen geografisch sind, desto genetisch ähnlicher sind sie. Populationsspezifische Allele wurden sowohl in STR- als auch in SNP-Markern gefunden. Genetische Muster der Variation der menschlichen Bevölkerung sind aus einer Reihe von sequentiellen Migrations- und Engpassereignissen hervorgegangen.

Was ist Next Generation Sequencing (NGS)?Analyse genetischer Marker von Vorfahren

SNPs eignen sich aufgrund ihrer geringeren Mutationsrate besser zur Fixierung in einer Population als STRs. Während sich SNPs alle hundert Generationen nacheinander ändern, beträgt die STR-Mutationsrate ungefähr eins zu tausend. Lineage Informative Marker (AIMs) haben Allele mit großen Frequenzunterschieden, die zur Unterscheidung beitragen können. Eine kleine Anzahl von SNP-Varianten hat sich als besonders informativ für Vorfahren herausgestellt. Und vergleichen Sie sie mit Variationsmustern in ihren verschiedenen Populationen. Bei der Auswahl der geeigneten informativen Abstammungsmarker wirken sich der Grad der Divergenz zwischen den Populationen und die Anzahl der Populationen, die ein Test zu unterscheiden versucht, auf den Auswahlprozess aus.
Die Linienextraktion bietet viele andere Anwendungen, einschließlich der Unterstützung bei kalten Fallstudien mit zusätzlichen Daten in verknüpften Profilen. Es ermöglicht eine umfassendere Identifizierung vermisster Personen oder Opfer von Katastrophen. Es bewertet auch atypische Kombinationen von körperlichen Merkmalen bei Personen mit gemischten Eltern. Und wo forensische Sensibilität erforderlich ist, wird sie verwendet, um genetische Studien zu erweitern, z. B. das Testen von medizinischem Archivmaterial oder archäologischer DNA. AIMs sind jedoch nicht 100% genau für die Vorhersage des Ahnenverlaufs von Proben. Beispielsweise haben Personen mit gemischter Abstammung möglicherweise nicht die erwarteten phänotypischen Merkmale. Ergebnisse von Gentests sollten daher immer mit Vorsicht und nur im Zusammenhang mit verlässlichen Nachweisen interpretiert werden.
In Ländern, in denen die Bevölkerungsbewegung intensiver ist, wird ein höheres Maß an Vermischung erwartet. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Ergebnisse von Gentests stark mit dem geografischen Standort korrelieren. Die Wahrscheinlichkeit einer zusätzlichen Abstammung wirft jedoch eine Warnung bei der Verwendung von Statistiken mit einem AIM-Panel auf. Eine gemischte Abstammung kann nur dann vollständig vorhergesagt werden, wenn die Ahnenpopulationen unter den Referenzpopulationen vertreten sind. Die AIMs sind begrenzt. Die Definition optimaler SNPs kann zwischen den Probenchargen variieren. Einige Panels basieren auf zu vielen SNPs und schränken daher die Fähigkeit anderer ein, verschiedene Populationen zu testen. Ziele in forensischen genetischen Studien am Tatort können mit sehr kleinen DNA-Mengen von weniger als 1 ng erreicht werden. Die Strategie zur Interpretation der Ergebnisse von AIM-Überprüfungen kann aufschlussreich sein. Die Wahrscheinlichkeit von AIM-Profilen in verschiedenen Populationen kann berechnet werden. Es kann als die Herkunftspopulation mit der höchsten Wahrscheinlichkeit angesehen werden. Wenn zuvor zwei Populationen identifiziert wurden, werden die Wahrscheinlichkeitsverhältnisse der Populationen berechnet.
Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Population größer als eine andere ist, beweist nicht, dass eine der beiden Populationen mit dem AIM-Profil zusammenhängt. Denn obwohl die Populationen exklusiv sind, sind sie nicht umfassend, um alle möglichen Menschen abzudecken. Aufgrund der ständigen Übergänge werden AIM-Allele von allen Personengruppen geteilt. Es ist nicht die absolute Anwesenheit oder Abwesenheit eines Allels, sondern seine Häufigkeit in der Population, die normalerweise analysiert wird, wenn der Vorfahr entfernt wird. Die Rekombination von autosomalen Markern kann zusätzliche Informationen über die Verwirrung eines Individuums liefern. Y-Chromosomenmarker und Variation der mitochondrialen DNA (mtDNA) -Sequenz haben Vor- und Nachteile für Rückschlüsse von Vorfahren in Bezug auf mütterliche und väterliche Abstammungslinien. INDELs können auch wertvolle AIMs sein, aber die Anzahl der Token und der informative Wert sind geringer als die von SNPs.

Analyse genetischer Marker der phänotypischen Expression

Die forensische Phänotypisierung kann nützliche Informationen bezüglich der Abstammungslinie und der extern sichtbaren Eigenschaften (EVCs) des Spenders einer Beweisprobe liefern. Heutzutage ziehen SNPs die grundlegende Schlussfolgerung von außen sichtbaren Merkmalen. In Fällen, in denen die DNA des Täters vorhanden ist, der Verdächtige jedoch nicht identifiziert wurde, kann dies die Zeugenaussage ersetzen und unterstützen, wenn Definitionen nicht verfügbar oder unklar sind.
Das ultimative Ziel der Vorhersage von Phänotypen von EVCs anhand von DNA-Genotypen besteht darin, polizeiliche Ermittlungen zu unterstützen, um unbekannte Personen zu finden. Bei der Individualisierung von DNA für den Gerichtssaal kann eine standardmäßige forensische STR-Profilerstellung (DNA-Fragmente) nur nützlich sein, um die Anzahl der gezielten EVC-übereinstimmenden Verdächtigen zu verringern, wenn geringe Mengen an DNA ohne Datenbankübereinstimmungen verfügbar sind. Die Fähigkeit, das physische Erscheinungsbild einer Person direkt aus Tatortmaterial vorherzusagen, begrenzt im Prinzip die große Anzahl potenzieller Verdächtiger, einschließlich unbekannter Täter, wenn die STR-Profilerstellung keinen Treffer in der DNA- (Profil-) Datenbank liefert. Auf diese Weise kann er bei polizeilichen Ermittlungen behilflich sein. Dies gilt entweder, wenn es nicht mit einem von den Behörden ausgewählten Verdächtigen übereinstimmt oder wenn aufgrund der geringen Qualität der verfügbaren DNA kein STR-Profil erstellt werden kann.
Es wird erwartet, dass ein nicht identifiziertes Objekt EVCs zur Identifizierung des Menschen führt. Es werden jedoch noch Studien durchgeführt, um andere DNA-Marker wie Hautfarbe, Haarfarbe, Körpergröße, männliche Kahlheit und Haarmorphologie zu bestimmen. Zahlreiche globale Studien identifizieren Varianten der Haut-, Haar- und Irispigmentierung, des biologischen Stoffwechsels und der biologischen Veränderung mit der geografischen Verteilung der Bevölkerung. Es werden auch Korrelationen zwischen Variationen der Allelfrequenzen identifiziert, die mit verschiedenen menschlichen Phänotypen zusammenhängen, einschließlich der Anfälligkeit für Krankheiten und der Morphologie. Weil erwartet wird, dass diese Unterschiede eine große Bevölkerungsvielfalt aufweisen. Forscher haben möglicherweise Schwierigkeiten, Inzuchtwahrscheinlichkeiten oder Phänotypvorhersagen unter Verwendung von DNA-Ergebnissen zu verstehen.

Was ist Next Generation Sequencing (NGS)?Genetische DNA-Datenbank

Forensische Genetik ist in vielen Straf- und Zivilverfahren zu einem Schlüsseltest für die Fähigkeit geworden, einen Verdächtigen zu bestätigen oder zu eliminieren. Es ermöglicht die Analyse und Bestimmung von Kriminalitätsstrategien sowie die Verbesserung des Justiz- und Polizeimanagements im Bereich der Kriminalität. DNA-Datenbanken verfolgen die Lösung von Strafsachen und ermöglichen den automatischen Vergleich von Verdächtigen oder Verurteilten und manchmal Opfern.
Der Nutzen einer solchen Datenbank ist in allen Ländern, in denen sie existiert, unbestritten. Die Gesetzgebung jedes Landes unterscheidet sich in bestimmten Punkten, die diese Probleme betreffen. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Bestimmung, welche Labors DNA-Profile erstellen können, die in der Datenbank enthalten sind. In naher Zukunft werden die Industrieländer wahrscheinlich Kooperationsabkommen über den Austausch genetischer Daten schließen, die ein grundlegendes Instrument zur Bekämpfung einiger Verbrechen sein können. Für öffentliche Einrichtungen ist es wichtig, den Umfang dieser Datenbanken zu kennen und Kooperationsvereinbarungen für den Informationsaustausch und die Zusammenstellung zu strafrechtlichen Ermittlungszwecken zu erstellen.

Verweise:
europepmc.org/articles/pmc4637504
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-31802002000300004

Schriftsteller: Ozlem Guvenc Agaoglu

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